An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Спочатку ми досліджували оптимальну концентрацію PVP з використанням Arabidopsis зрілих насіння. Загальну РНК виділяли з приблизно 1000 насінин відповідно до протоколу, описаним вище, з використанням буфера для лізису клітин, що містить 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% або 2,0% PVP. Після гомогенізації і центрифугування супернатант збирали, уникаючи при цьому шар масла і насіння сміття (рисунок 1А).

Малюнок 1: Оцінка оптимальної концентрації полівінілпіролідону в буфері для лізису клітин. Сумарну РНК екстрагували з буфера для лізису клітин, що містять різні концентрації PVP. (А) Фотографія насіння після гомогенізації і центрифугування. (Б) Графіки довжин хвиль оптичної щільності для кожного зразка вказані. Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Кількість і чистота виділених РНК оцінювали з графіка довжин хвиль оптичної щільності (рис 1б), який показав, що 1,0% PVP, була найбільш ефективною концентрацією виділення великої кількості очищеної РНК з насіння.

Країни, що розвиваються насіння були виділені з Різушка Таля фруктів на попередньо охолоджених алюмінієвих пластин на льоду під (2А, 2В фігурах) стереомикроскопа. Насіння гомогенизировали з товкачем з нержавіючої сталі і мотор-м'ясорубки в трубі на алюмінієвій стійці на льоду (рис 2C, 2D).

2.jpg "/>
Малюнок 2: Виділення і гомогенізація розвитку насіння Різушка Таля. Країни, що розвиваються насіння виділяють з плодів на холодній алюмінієвій пластині під стереомикроскопа (A). Плодолистки очищені від ніжку (B), і країни, що розвиваються насіння збирають. Насіння гомогенизируют в буфері для лізису, що містить 1% (вага / об'єм) полівінілпіролідону з використанням нержавіючої сталі товкачем (С) в трубах в алюмінієвій стійці охолоджували на льоду (D). Будь ласка , Натисніть тут , щоб подивитися збільшену версію цієї фігури.

Загальну РНК виділяли з насіння на 4, 8 і 12 днів після цвітіння (надалі DAF) за допомогою нашого недавно розроблений метод або звичайний метод. Концентрації, відносини A260 / A280 і A260 / A230 співвідношення РНК, виділеної з 200 насіння, наведені в таблиці 1.

метод DAF концентрація РНК A260 / A280 A260 / A230 загальноприйнятий 4 72,4 ± 7,4 1,90 ± 0,02 2,27 ± 0,06 8 10,8 ± 3,0 1,50 ± 0,08 1, 40 ± 0,17 12 4,9 ± 1,7 1,57 ± 0,10 0,76 ± 0,18 новий 4 63,7 ± 2,6 2.10 ± 0.08 2,29 ± 0,03 8 46,3 ± 4,9 2,15 ± 0,05 2,23 ± 0,09 12 41,77; 3.1 2,09 ± 0,04 2,17 ± 0,07

Таблиця 1: концентрації, співвідношення A260 / A280 і A260 / A230 співвідношення РНК, виділеної з насіння Arabidopsis. Загальну РНК виділяли з приблизно 200 насіння (від 190 до 206 насіння) на 4, 8, 12 і ДАФ з використанням традиційного методу або наш недавно розроблений метод. Були виміряні концентрації РНК, відносини A260 / A280 і A260 відносини / A230. Значення представляють собою середнє ± стандартне відхилення трьох незалежних експериментів.

Результати показують, що наш метод дозволив нам виділити високоочищеного РНК з 8 і 12 насіння DAF. Загальну РНК зворотної транскрипції в кДНК, і кДНК розчини розбавляли в 100 разів. У копії номера WRI1 (зморшкуватий 1: AT3G54320), SDP1 (ЦУКОР DEPENDENT1: AT5G04040) 7 </ SUP> і EIF3K (еукаріотичних фактор ініціації переказу 3K: AT4G33250) в якості внутрішнього контролю 8 були виміряні, і відносні кількості транскриптов оцінювали за допомогою кількісної ПЛР в реальному часі аналізує (рисунок 3).

Малюнок 3: Кількісне транскриптов низького рівня в країнах, що розвиваються насіння. Сумарну РНК екстрагували з 4-х, 8, і 12 насіння DAF за допомогою нашого методу, і готували розчини кДНК. Відносні кількості WRI1 (А) і SDP1 (В) транскриптов були виміряні за допомогою кількісного ПЛР реального часу. EIF3K був використаний в якості внутрішнього контролю. Значення представляють середнє SD трьох незалежних експериментів. DAF; днів після цвітіння. Будь ласка , натисніть він повторно переглянути велику версію цієї фігури.

Хоча кількість WRI1 і SDP1 транскриптов відносно низькі в країнах, що розвиваються насінні, можна було виявити зміни експресії між насінням на різних стадіях розвитку. Для того, щоб переконатися в тому, що наш метод може бути використаний в інших олійних культур, загальна РНК виділяли з зрілих насіння Brassica Паріз і гліцин макс. Концентрації РНК, відно A260 / A280 і відносини А260 / A230 наведені в таблиці 2.

метод Рослина концентрація РНК A260 / A280 A260 / A230 загальноприйнятий B. Паріз 7,7 ± 0,8 1,5 ± 0,12 0,75 ± 0,11 G. макс 1,61 ± 0,06 0,69 ± 0 , 09 новий B. Паріз 143,2 ± 19,0 2,17 ± 0,03 2,23 ± 0,13 G. макс 152,3 ± 4,4 2,17 ± 0,02 2,30 ± 0, 02

Таблиця 2: концентрації, співвідношення A260 / A280 і A260 / A230 співвідношення РНК, виділеної з зрілих насіння Brassica Паріз і Гліцин макс. Загальну РНК виділяли з приблизно 100 мг Brassica Паріз і гліцин макс насіння з використанням традиційного методу або наш недавно розроблений метод. Насіння були попередньо подрібнений і грубо гомогенизируют за допомогою ступки і маточки, охолодженої в рідкому азоті. Концентрації РНК, A260 / Aбилі виміряні 280 відносини і відносини A260 / A230. Значення представляють собою середнє ± стандартне відхилення трьох незалежних експериментів.